Genomové sekvence většiny virů jsou známy.Sondy nukleové kyseliny, které jsou krátkými segmenty DNA navrženými tak, aby hybridizovaly s komplementárními virovými segmenty DNA nebo RNA.Polymerázová řetězová reakce (PCR) je účinnější technikou pro detekci virů.Nedávno byly vyvinuty vysoce výkonné diagnostické metody.
A. Technika hybridizace nukleových kyselin
Hybridizace nukleových kyselin, zejména zahrnující Southern blotting (jižní) a Northern blotting (severní), je rychle se rozvíjející novou technikou v oblasti diagnostiky virů.Principem hybridizačního testu je použití krátkých segmentů DNA (nazývaných „sonda“) určených k hybridizaci s komplementárními segmenty virové DNA nebo RNA.Zahřátím nebo alkalickým ošetřením se dvouřetězcová cílová DNA nebo RNA rozdělí na jednotlivá vlákna a poté se imobilizují na pevném nosiči.Poté je přidána sonda a hybridizována s cílovou DNA nebo RNA.Protože je sonda značena izotopem nebo neradioaktivním nuklidem, cílová DNA nebo RNA může být detekována autoradiografií nebo systémem biotin-avidin.Protože většina virových genomů byla klonována a sekvenována, lze je detekovat pomocí sekvencí specifických pro virus jako sond ve vzorku.V současné době hybridizační metody zahrnují: dot blot, in situ hybridizaci v buňkách, DNA blotting (DNA) (Southern blot) a RNA blot (RNA) (Northern blot).
Technologie B.PCR
V posledních letech byla vyvinuta řada in vitro technik amplifikace nukleových kyselin založených na PCR k testování necitlivých nebo nekultivovatelných virů.PCR je metoda, která může syntetizovat specifickou sekvenci DNA in vitro polymerázovou reakcí.Proces PCR zahrnuje tepelný cyklus tří kroků: denaturace, nasedání a extenze Při vysoké teplotě (93℃~95℃) je dvouřetězcová DNA rozdělena do dvou jednoduchých řetězců DNA;poté při nízké teplotě (37 °C~60 °C) dva syntetizované nukleotidové primery nasedají na komplementární segmenty DNA;zatímco při vhodné teplotě pro enzym Taq (72 °C) začíná syntéza nových řetězců DNA od primeru 3' konce pomocí komplementární DNA jako templátů a jednotlivých nukleotidů jako materiálů.Takže po každém cyklu může být jeden řetězec DNA amplifikován na dva řetězce.Opakováním tohoto procesu lze každý řetězec DNA syntetizovaný v jednom cyklu použít jako templát v dalším cyklu a počet řetězců DNA se v každém cyklu zdvojnásobí, což znamená, že produkce PCR je amplifikována rychlostí 2n log.Po 25 až 30 cyklech je produkce PCR identifikována elektroforézou a specifické produkty DNA lze pozorovat pod UV světlem (254 nm).Pro svou výhodu specifičnosti, citlivosti a pohodlí byla PCR přijata v klinické diagnostice mnoha virových infekcí, jako jsou HCV, HIV, CMV a HPV.Protože PCR je velmi citlivá, dokáže detekovat virovou DNA na úrovni fg, operace by měla být prováděna velmi opatrně, aby nedošlo k falešné pozitivitě.Navíc pozitivní výsledek testu na nukleovou kyselinu neznamená, že je ve vzorku živý infekční virus.
Díky širokému použití techniky PCR se vyvíjejí nové techniky a metody založené na technice PCR pro různé účely testování.Například kvantitativní PCR v reálném čase může detekovat virovou zátěž;in situ PCR se používá k identifikaci virové infekce ve tkáni nebo buňkách;Nested PCR může zvýšit specificitu PCR.Mezi nimi byla rychleji vyvinuta kvantitativní PCR v reálném čase.Mnoho nových technik, jako je hydrolyzační sonda TaqMan, hybridizační sonda a sonda molekulárního majáku, bylo zkombinováno do techniky kvantitativní PCR v reálném čase, která je široce využívána v klinickém výzkumu.Kromě přesné identifikace virové zátěže v tělních tekutinách pacientů lze tuto metodu použít také k detekci mutanta tolerantního k léčivu.Kvantitativní PCR v reálném čase se proto používá hlavně při hodnocení léčebných účinků a sledování tolerance léků.
C. Vysoce výkonná detekce virových nukleových kyselin
Pro splnění potřeb rychlé diagnostiky nově vznikajících infekčních onemocnění byly zavedeny různé vysoce výkonné detekční metody, jako jsou DNA čipy (DNA).Pro DNA čipy jsou syntetizovány specifické sondy a připojeny k malým křemíkovým čipům ve velmi vysoké hustotě za vzniku DNA sondy microarray (DNA), kterou lze hybridizovat se vzorkem.Signál hybridizace může být zobrazen konfokálním mikroskopem nebo laserovým skenerem a dále zpracován počítačem a lze získat obrovský soubor dat týkajících se různých genů.Existují dva druhy DNA čipů.Syntézní čip je následující: specifické oligonukleotidy jsou syntetizovány přímo na čipech.Dalším je DNA pool chip.Klonované geny nebo produkty PCR jsou uspořádaně vytištěny na sklíčko.Výhodou technologie DNA čipů je současná detekce velkého množství sekvencí DNA.Nejnovější verze čipu pro detekci patogenů dokáže identifikovat více než 1700 lidských virů najednou.Technologie DNA čipů vyřešila problémy tradičních metod hybridizace nukleových kyselin a má velmi široké uplatnění ve virové diagnostice a epidemiologické studii.
Čas odeslání: 23. prosince 2020